Những cân nhắc thiết kế chính cho các giao thức nghiên cứu xác thực độ thanh thải virus của các sản phẩm trị liệu gen

ICH Q5A(R2)-Tổ chức Hài hòa Quốc tế

ICH Q5A(R2) được chính thức thông qua vào ngày 1 tháng 11 năm 2023 và là tài liệu hướng dẫn quốc tế cốt lõi để đánh giá độ an toàn của vi-rút. So với Q5A(R1) xuất bản năm 1999, những cập nhật quan trọng trong phiên bản R2 bao gồm: một chương mới được bổ sung về đánh giá an toàn virus trong sản xuất liên tục (Chương 7); vai trò được tăng cường của việc đánh giá rủi ro làm nền tảng cho các chiến lược loại bỏ virus; kết hợp giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) trong các cân nhắc phát hiện vi-rút; và các yêu cầu rõ ràng để đánh giá các sản phẩm và quy trình sản xuất mới. Q5A(R2) đã được các cơ quan quản lý bao gồm FDA, EMA và PMDA áp dụng, cung cấp một khung kỹ thuật thống nhất để xác nhận khả năng thanh thải virus trên toàn thế giới.

NMPA-Hệ thống quản lý của Trung Quốc

Khung pháp lý NMPA về an toàn vi-rút bao gồm nhiều cấp độ:

Cấp độ tài liệu	Tên tài liệu	Năm phát hành
Văn bản cơ sở	Hướng dẫn kỹ thuật để loại bỏ/vô hiệu hóa virus từ các sản phẩm máu	2002
Văn bản cơ sở	Nguyên tắc chung để đánh giá kỹ thuật về đánh giá an toàn vi rút của mô sinh học-Sản phẩm có nguồn gốc và tế bào nhân chuẩn-Sản phẩm được biểu hiện	2005
Nguyên tắc cụ thể về sản phẩm-	Hướng dẫn kỹ thuật dành cho nghiên cứu dược phẩm và đánh giá các ứng dụng thử nghiệm lâm sàng đối với Adeno tái tổ hợp-Vectơ vi rút liên quan (rAAV)-Dựa trên các sản phẩm trị liệu gen Vivo	2023
Nguyên tắc cụ thể về sản phẩm-	Yêu cầu kỹ thuật chung về chất lượng dược phẩm của Adeno tái tổ hợp-Vectơ vi rút liên quan (rAAV)-Dựa trên các sản phẩm trị liệu bằng gen Vivo cho các ứng dụng cấp phép tiếp thị	2025
Hướng dẫn đổi mới	Hướng dẫn kỹ thuật để xác nhận nền tảng các quy trình làm sạch virus cho các ứng dụng thử nghiệm lâm sàng của các sản phẩm protein tái tổ hợp trị liệu (Thử nghiệm)a	2024

a: Hướng dẫn này thể hiện lần đầu tiên cơ quan quản lý Trung Quốc đặt ra các yêu cầu kỹ thuật mang tính hệ thống để xác nhận nền tảng của các quy trình thanh lọc vi rút và phù hợp với tinh thần của ICH Q5A(R2).

FDA và EMA-Yêu cầu theo quy định của Hoa Kỳ và Châu Âu

FDA chính thức ban hành tài liệu hướng dẫn ngành dựa trên ICH Q5A(R2) vào tháng 1 năm 2024. Ngoài ra, chương Dược điển Hoa Kỳ (USP)<1050.1>cung cấp hướng dẫn kỹ thuật bổ sung về thiết kế, đánh giá và mô tả đặc tính của quy trình thanh lọc vi rút. FDA tổ chức Hội nghị chuyên đề về thanh thải virus hai năm một lần; hội nghị chuyên đề năm 2023 đề cập đến-các chủ đề tiên tiến như phương thức mới, sản xuất liên tục, phương tiện sắc ký mới và bộ lọc hấp phụ. Các tài liệu hướng dẫn cốt lõi của EMA bao gồm CPMP/BWP/268/95 (Lưu ý về Hướng dẫn về Nghiên cứu Xác thực Vi-rút: Thiết kế, Đóng góp và Giải thích các Nghiên cứu Xác thực Việc Vô hiệu hóa và Loại bỏ Vi-rút) và EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Hướng dẫn Đánh giá An toàn Vi-rút đối với các Sản phẩm Y học Nghiên cứu Công nghệ Sinh học), cả hai đều đã được hài hòa với ICH Q5A(R2).

Xác định nguồn lây nhiễm virus

ICH Q5A(R2) nhấn mạnh rằng việc thiết kế xác nhận độ thanh thải virus phải dựa trên đánh giá rủi ro toàn diện. Đối với các sản phẩm liệu pháp gen, việc xác định nguồn lây nhiễm virus cần giải quyết các mức độ sau:

Cấp độ ngân hàng tế bào: Vi rút nội sinh (ví dụ: các hạt retrovirus) và vi rút lây nhiễm tiềm tàng có khả năng ẩn náu trong chất nền tế bào sản xuất (ví dụ: HEK293, CHO, HeLa). Các tế bào HEK293 được biết là có chứa các chuỗi Ad5 E1 nội sinh và một đoạn EBV khoảng 900 bp, đồng thời có khả năng biểu hiện-adenovirus có khả năng sao chép; do đó, cần đặc biệt chú ý đến rủi ro này trong quá trình đánh giá rủi ro.

Cấp độ vi-rút trợ giúp: Việc sản xuất vectơ AAV thường sử dụng các phương pháp như truyền ba lần bằng cách sử dụng các plasmid trợ giúp, có nguy cơ tạo ra-adenovirus có khả năng sao chép (RCA). Tương tự, các tế bào đóng gói được sử dụng trong sản xuất vectơ lentivirus có thể tạo ra lentillin có khả năng sao chép (RCL).

Cấp độ nguyên liệu thô: Vi rút bất ngờ có thể được đưa vào thông qua các nguyên liệu thô được sử dụng trong sản xuất, bao gồm môi trường nuôi cấy tế bào, thức ăn và enzyme. Nguy cơ này đặc biệt nghiêm trọng khi sử dụng các thành phần có nguồn gốc từ động vật (ví dụ: huyết thanh bào thai bò, dung dịch tiêu hóa trypsin).

Sự khác biệt về rủi ro: Liệu pháp gen so với Protein tái tổ hợp truyền thống

Thứ nguyên rủi ro	Sản phẩm Protein tái tổ hợp truyền thống	Sản phẩm trị liệu gen
Nguồn virus	Virus nội sinh từ ngân hàng tế bào; virus ngẫu nhiên	Virus ngân hàng tế bào; virus trợ giúp; sao chép-vectơ có thẩm quyền (RCV/RCL); tích hợp bộ gen của vật chủ
Chất nền tế bào	CHO, NS0, Sp2/0 và các dòng tế bào-có đặc tính tốt khác	HEK293, HeLa, CHO, v.v.; một số dòng tế bào có nguồn gốc khối u
Đặc tính sản phẩm	Thuốc dựa trên protein; cấu trúc-được xác định rõ ràng	Vectơ virut; gây nguy cơ mất an toàn sinh học
Chiến lược xác thực	thanh lọc vi rút qua nhiều{0}}bước; nhấn mạnh vào xác nhận bước quy trình	Yêu cầu phát hiện RCV/RCL; xác nhận và kiểm tra đều cần thiết
Xác thực nền tảng	Áp dụng cho các quy trình đã được thiết lập như S/D, pH thấp, lọc nano	Khả năng ứng dụng hạn chế do tính đa dạng của các loại vectơ

Bảng 1. So sánh rủi ro về an toàn virus: Sản phẩm trị liệu gen so với sản phẩm protein tái tổ hợp truyền thống

Nguyên tắc chung

Lựa chọn vi-rút chỉ thị là yếu tố trung tâm trong việc thiết kế các quy trình xác nhận độ thanh thải vi-rút. ICH Q5A(R2) yêu cầu việc lựa chọn vi-rút chỉ báo phải dựa trên đánh giá rủi ro và tính đến các yếu tố sau:

Sự liên quan của virus với chất nền tế bào sản xuất (virus liên quan)

Đặc tính hóa lý của vi-rút (có vỏ/không{0}}có vỏ, DNA/RNA, phạm vi kích thước)

Sức đề kháng của virus đối với các phương pháp điều trị vật lý/hóa học

Khả năng phát hiện và an toàn sinh học của virus

Đối với các sản phẩm liệu pháp gen, việc lựa chọn virus chỉ thị còn phải xem xét thêm: vai trò của bản thân virus vector là “virus liên quan”; nguy cơ tiềm ẩn nhiễm virus trợ giúp; cũng như các yêu cầu về phát hiện và xác thực để sao chép-các vi-rút có khả năng (RCV/RCL).

Bảng điều khiển vi-rút chỉ báo được đề xuất

Vi-rút	Kiểu	Phong bì	bộ gen	Kích thước (nm)	Lý do lựa chọn/Ứng dụng
MVM	Parvovirus	Không có	ssDNA	18–26	Mô hình không{0}}có vỏ bọc; kích thước nhỏ nhất và điện trở cao nhất; thích hợp để xác nhận quá trình lọc nano (thường không áp dụng cho các sản phẩm vectơ rAAV)
PPV	Parvovirus	Không có	ssDNA	18–26	Mô hình không{0}}có vỏ bọc; virus chỉ thị thường được sử dụng cho các sản phẩm máu
Reo-3	Reovirus	Không có	dsRNA	60–80	Mô hình không{0}}có vỏ bọc; kích thước trung bình; độ ổn định thể chất cao
PRV	Họ Herpesviridae	Đúng	dsDNA	150–200	mô hình bao bọc; kích thước lớn; phạm vi máy chủ rộng
X-MuLV	Retrovirus	Đúng	ssRNA	80–110	Mô hình retrovirus bao bọc; thích hợp cho chất nền tế bào có nguồn gốc CHO{0}}
BVDV	Họ Flaviviridae	Đúng	ssRNA	40–60	mô hình bao bọc; được sử dụng để đánh giá các phương pháp khử hoạt tính hóa học (chất thay thế HCV)
VSV	Họ Rhabdoviridae	Đúng	ssRNA	70	mô hình bao bọc; dung sai pH rộng; thích hợp để xác thực quá trình khử hoạt tính ở độ pH- thấp

Bảng 2. Bảng chỉ số vi-rút được khuyến nghị để xác nhận độ thanh thải vi-rút của các sản phẩm trị liệu gen

Những cân nhắc đặc biệt đối với các sản phẩm Vector AAV

Đối với các sản phẩm vectơ AAV tái tổ hợp, Hướng dẫn kỹ thuật của NMPA dành cho nghiên cứu dược phẩm và đánh giá các ứng dụng thử nghiệm lâm sàng đối với vectơ rAAV-Các sản phẩm trị liệu gen trên cơ thể Vivo yêu cầu chú ý đến việc phát hiện sự sao chép-AAV có thẩm quyền (rcAAV). RCAAV đề cập đến AAV có khả năng sao chép tự động, thường phát sinh từ sự tái tổ hợp tương đồng giữa plasmid trợ giúp và bộ gen AAV của sản phẩm. Việc phát hiện RCAAV thường được thực hiện bằng cách sử dụng các xét nghiệm lây nhiễm hoặc phương pháp qPCR, được tiến hành riêng biệt trên dược chất và sản phẩm tinh khiết.

Điều đáng chú ý là các quy trình tinh chế tiếp theo đối với các sản phẩm vectơ AAV thường bao gồm phân hủy nuclease, sắc ký (AEX), lọc nano và sắc ký trao đổi ion (CEX/IEX). Trong xác nhận độ thanh lọc virus truyền thống, các bước quy trình này có thể dẫn đến tổn thất đáng kể vectơ AAV; do đó, sự tương tác giữa vectơ và vi rút chỉ báo phải được xem xét cẩn thận trong quá trình thiết kế mô hình-thu nhỏ. Đối với các bước quy trình nhất định (ví dụ: lọc nano) trong đó tổn thất vectơ AAV là đáng kể, cần đánh giá xem liệu việc điều chỉnh quy trình có được đảm bảo hay không dựa trên dữ liệu xác nhận (ví dụ: điều chỉnh kích thước lỗ màng lọc nano).

Nguyên tắc chung

Mô hình-giảm quy mô (SDM) là công cụ cốt lõi để xác thực mức độ thanh thải vi rút; thiết kế của nó phải thể hiện chính xác hiệu suất loại bỏ virus của quy trình sản xuất. ICH Q5A(R2), Mục 6.2.2, yêu cầu rõ ràng rằng mô hình- thu nhỏ duy trì tính nhất quán với quy trình sản xuất trong các thông số chính. Đối với các sản phẩm liệu pháp gen, những cân nhắc sau đây đặc biệt quan trọng trong thiết kế SDM:

Tính đại diện của các thông số quy trình quan trọng

Mô hình-giảm tỷ lệ phải nhất quán với quy trình sản xuất ở các thông số sau: điều kiện sắc ký (thành phần đệm, độ pH, độ dẫn điện); tỷ lệ tải (tỷ lệ khối lượng vectơ/protein nổi); thời gian và nhiệt độ tiếp xúc; tốc độ dòng chảy/thời gian lưu trú; độ tinh khiết và thành phần của sản phẩm. Đối với các sản phẩm AAV, ảnh hưởng của sự phân bố kích thước hạt vectơ và hàm lượng vỏ bọc rỗng đến hiệu suất lọc nano cũng cần được giải quyết cụ thể.

Yêu cầu về trình độ chuyên môn của người mẫu

ICH Q5A(R2) yêu cầu trình độ chuyên môn đầy đủ của mô hình-giảm quy mô, bao gồm: so sánh các thuộc tính chất lượng sản phẩm (ví dụ: độ tinh khiết, độ thu hồi, mật độ); đánh giá tính nhất quán của thông số quá trình quan trọng; và đảm bảo mô hình-thu nhỏ quy mô nắm bắt được tính biến đổi của quy trình trong quy trình sản xuất. Đối với các bước sắc ký, độ đặc của pic, rửa giải và rửa phải được đánh giá cao; đối với các bước lọc nano, cần xác minh ảnh hưởng của dung tích thể tích và thành phần sản phẩm.

Công thức tính LRV

Giá trị giảm log (LRV) là số liệu cốt lõi để đo lường hiệu quả thanh thải virus. ICH Q5A(R2), Phần 6.5, cung cấp mô tả chi tiết về phương pháp tính toán LRV và xử lý thống kê. Công thức tính LRV cơ bản là: LRV=log₁₀(N₀/N), trong đó N₀ là hiệu giá vi rút ban đầu sau khi tăng đột biến vi rút và N là hiệu giá vi rút còn sót lại sau quá trình xử lý. Khi hiệu giá vi rút còn sót lại giảm xuống dưới giới hạn phát hiện của xét nghiệm, nên sử dụng các phương pháp ước tính như phân bố Poisson (ví dụ: xét nghiệm-khối lượng lớn).

Ứng dụng khoảng tin cậy

Cả ICH Q5A(R2) và EMA CPMP/BWP/268/95 đều yêu cầu đánh giá khoảng tin cậy của kết quả tính toán LRV. Khoảng tin cậy 95% thường được áp dụng.

Tiêu chí Hiệu quả

Theo Hướng dẫn kỹ thuật của NMPA về loại bỏ/bất hoạt vi-rút khỏi các sản phẩm máu, mức giảm vi-rút Lớn hơn hoặc bằng 4 nhật ký cho thấy rằng bước quy trình này có hiệu quả trong việc loại bỏ/bất hoạt vi-rút. Tuy nhiên, tiêu chí này không phải là ngưỡng tuyệt đối và cần được đánh giá một cách tổng thể cùng với các đường cong động học bất hoạt, cơ sở khoa học cho việc lựa chọn virus chỉ thị và tính hợp lý tổng thể của thiết kế quy trình xác nhận. Đối với các sản phẩm liệu pháp gen, cần đặc biệt chú ý đến khả năng thanh lọc tích lũy trong tất cả các bước quy trình để đảm bảo rằng hồ sơ an toàn virus tổng thể ở mức chấp nhận được.

Ứng dụng và thách thức của lọc nano

-Lọc lưu giữ vi-rút (lọc nano) là một bước loại bỏ vi-rút quan trọng trong quá trình tinh chế các sản phẩm liệu pháp gen ở giai đoạn tiếp theo. Các bộ lọc lưu giữ vi-rút điển hình-có kích thước lỗ khoảng 20 nm. Cơ chế thanh lọc vi rút của quá trình lọc nano chủ yếu là loại trừ dựa trên kích thước- và nó có thể loại bỏ hiệu quả hầu hết các vi rút lớn hơn kích thước lỗ màng, bao gồm cả các vi rút parvovirus nhỏ không có vỏ bọc như MVM và PPV.

Tuy nhiên, quá trình lọc nano cho các sản phẩm liệu pháp gen phải đối mặt với những thách thức đặc biệt: kích thước của vectơ AAV (khoảng 20–26nm) tương tự như kích thước của một số virus chỉ thị (ví dụ: MVM, 18–26 nm), có thể dẫn đến giảm khả năng phục hồi vectơ; các viên nang rỗng có thể ảnh hưởng đến tốc độ lọc và hiệu quả lưu giữ virus; độ nhớt của mẫu có thể tăng đáng kể theo nồng độ vectơ. Do đó, thiết kế SDM để xác nhận lọc nano phải tính đến đầy đủ các tác động của phân bố kích thước hạt vectơ và hàm lượng vỏ bọc rỗng đến hiệu suất lọc và cần cân nhắc sử dụng màng lọc nano có kích thước lỗ lớn hơn nếu thích hợp.

Đánh giá độ thanh thải virus của các bước sắc ký

Sắc ký trao đổi ion (IEX) là bước cốt lõi trong quy trình tinh chế sản phẩm AAV, thường sử dụng quá trình phân hủy nuclease sau đó là sắc ký trao đổi anion (AEX) để thu giữ các viên nang rỗng và khiếm khuyết, hoặc sắc ký trao đổi cation (CEX) để tinh chế tốt các viên nang đầy đủ. Cơ chế thanh thải virus trong các bước sắc ký bao gồm loại trừ kích thước, tương tác tĩnh điện, tương tác ái lực và các yếu tố khác. Các cuộc thảo luận tại Hội nghị chuyên đề về thanh thải vi rút của FDA năm 2023 đã nhấn mạnh rằng hiệu quả thanh lọc vi rút của các bước sắc ký bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm khả năng tải, độ pH, độ dẫn điện và chu trình nhựa; nên áp dụng phương pháp thiết kế trực giao đa yếu tố để đánh giá toàn diện.

Kiểm soát an toàn vi-rút trong sản xuất liên tục

Chương 7 mới được bổ sung của ICH Q5A(R2) đặt ra các yêu cầu cụ thể để đánh giá độ an toàn của vi-rút trong sản xuất liên tục. Đối với các sản phẩm liệu pháp gen, sản xuất liên tục đã trở thành một hướng phát triển quan trọng nhưng nó cũng đặt ra những thách thức mới về an toàn virus. Các chiến lược kiểm soát an toàn vi-rút trong sản xuất liên tục bao gồm:-bộ lọc hàng rào vi-rút trong dây chuyền làm biện pháp ngăn chặn quan trọng; thiết kế phù hợp về thời gian lưu trú và quy trình xử lý; kết hợp các bước vô hiệu hóa với thời gian lưu giữ xác định; và ứng dụng nâng cao của công nghệ phân tích quy trình (PAT) để giám sát-thời gian thực các thông số quan trọng của quy trình.